分析共聚焦显微镜的Z轴分辨率

浅谈共聚焦显微镜的Z轴分辨率

共聚焦显微镜是靠提高反差消除Z轴的干扰杂光提高的清晰度。普通的荧光显微镜在Z轴方向的精度和共聚焦没有办法比的，虽然现在的Z轴马达可以达到很高的精度，但因为Z轴分辨率不够，即便沿Z轴做多层采集，Zui后采集到的仍然一个图像。

图中示意一个图像沿Z轴纵切，假设我们的Z轴马达很精细，可以做从n1 到 n5的5个Z轴的不同位置的XY平面图像采集。但由于使用物镜的Z轴分辨率比较差，实际上从n2 到 n5采集到的都是同一个图像。但如果使用共聚焦，还是同样的物镜，Z轴分辨率比普通荧光显微镜有显著提高，n2 到 n5 层面采集到就可能是不同的图像。
不是物镜，不是马达，而是针孔决定了显微镜的Z轴分辨率。针孔是共聚焦的核心部件，也是共聚焦昂贵价格的原因所在。对针孔的控制同对激光器的控制及软件算法一样是这套系统的核心技术。针孔越小，样品层的光切面厚度就越薄，图像就越精确，但针孔的孔径Zui小不能低于一个艾里斑（AIRY UNIT），否则光线会发生衍射。所谓多针孔解决的是不同波长的激光同时扫描样品时对样品成像有相等的厚度。XY分辨率还是取决于物镜，服从阿贝的光学分辨率公式，如果说分辨率有些提高是因为提高了信号点的对比度，Z轴方向上取决于针孔，针孔限定了非焦平面的成像，但针孔不能无限制的小。实际使用中在130um左右。