徕卡显微镜宽视场超分辨率与GSDIM的关系说明

在生物学巨大进步已经能够通过使用荧光显微镜。 到目前为止，图像的分辨率由于物理限制的限制。 在过去的几年中，新的发展方式规避这些限制，并把荧光显微镜分辨率的一个新的水平，提高准备在科学荧光显微镜。 基态耗尽其次是个别分子回报 （GSDIM）是一个本地化的显微技术。 该技术是能够解决细节小至20纳米 。 这使得单一的蛋白质结构和生物分子在细胞研究和观察分子过程。 之一的GSDIM方法比其它定位技术的主要优点是，它可以用在生物医学研究中常规应用的标准荧光标记被使用。

定位显微镜

常规荧光显微镜图像的分辨率由衍射到所发射的光的约一半的波长的限制。 分离被紧密联系起来的溶液是需要克服阿贝衍射极限荧光标记的结构。 Zui常见的超分辨方法，成像超越衍射极限的定位显微镜，SIM（结构照明）和STED（受激发射损耗显微镜）。

基态耗尽之后个别分子回报（GSDIM）是一个本地化的显微技术。 在一般情况下，定位显微镜不看的同时发光荧光合奏，但清楚地分开，单独的荧光团可与纳米精度进行本地化。 随着时间的推移，各荧光团标记的生物结构的位置被确定，并且基于每个荧光团的位置信息的图像被重新构造，在硅片。 面临的挑战是有效地单数的荧光团的合奏，以允许单分子检测。

GSDIM - 分子基础

在GSDIM关键的一步是暂时切换大多数荧光团关闭，允许单个荧光团的精确定位。 为此，高强度的激发光被用于在该样品中，几乎所有荧光团变成暗这样的方式，只留下单一的，分离良好的荧光团发出荧光，这是纳米精度定位的先决条件。 

图1（右）：基于简化雅布隆斯基图上的GSDIM方法的示意图。 在荧光团离域π电子可以是，例如，在地面状态S 0>，处于兴奋状态S 1（两个所谓的导通状态），或在一个三重或自由基暗状态（均为OFF状态）。 当荧光灯被发射时，电子在地面和激发态之间循环。 不同于这些ON状态，在OFF状态下的荧光团不能发光。 这些断状态通常是长寿命的，但它们是难以实现，作为一个系统间交叉是必需的。 通过设置合适的环境条件下，在包埋介质，并通过标准荧光团对于免疫荧光的明智的选择，所以能够可逆地关闭的荧光团通过激励它们与一个极端的光强度。 当足够的分子处于OFF状态时，它能够检测单个分子的样品中。

分子状态之间的转换

图2：宽视场与GSDIM。 PTK2细胞。 NPC染色：抗NUP153 / AlexaFluor 532微管染色：抗β微管蛋白/ AlexaFluor 647礼貌：沃纳富凯，徕卡与安娜丝卡和Jan Ellenberg，EMBL，德国海德堡协作

一旦荧光样品通过（激光）光激发，电子被光子一跃成为第一激发态。上从第一态返回到基态时，光略低能量（红移）射出。 更高的激光功率增大的光子能打到在地面状态的电子和电子转移到激发态的数量。 其结果是，在一给定时间的基态和激发态之间的采样周期更多的电子。 发射的光子数增加和更亮的样品可以看到。

激发光（例如，从高功率激光源）的进一步增加可以导致调光器样品，由于减少荧光发射。 在这个过程的开始，增加激发光导致许多电子在地面与第一激发态之间循环的高。 从激发态电子的一定比例进入断电状态。 唯一可访问的子状态从第一激发态是三重态。 进入三线态需要一个自旋翻转电子的。 旋翻转具有非常低的发生概率，因此是一种非常罕见的事件。 由此关闭状态实际上是未填充的样品的低光照射。

关状态有很长的寿命（以μs为s的范围内），并用荧光团在关机状态下的电子不能参与样品的任何更多的荧光发射。 随着时间的推移越来越多的电子Zui终在关断状态，虽然荧光团的总数并没有改变的样品显示暗。 只是“主动”或“访问”荧光数量已经改变。 在关断状态“泵送”电子可以被看作是一个可逆开关。 荧光团被关闭，以电子驻留在关断状态的时间。 当电子返回到基态时，所述荧光团被渲染“有效的”，并且可以再次发出荧光。电子的分子状态之间的所有转换是概率管理的进程，因此，过渡的确切发生无法预测对于给定的电子。（奥林巴斯显微镜）

本地化高达纳米精度

图3（右）：宽视场与GSDIM。 高尔基体膜蛋白Giantin和高尔基体基质蛋白GM130，免疫荧光染色的Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 488，分别。 礼貌靖冈田博士，细胞生物学系和解剖学，医学研究生院，东京大学，日本。

对超分辨率成像的激光功率保持在一个较高的水平，直到只有几个荧光团中的视场发射光子。“活性”荧光团可以循环到地面和第一激发态之间的数千倍，电子返回到关断状态之前产生的光子的“突发”。 光子“突发”被记录用高敏感的EMCCD相机。 此外，只有少数电子填充的基态的时间很短，导致“基态耗尽与个别分子返回”（GSDIM）的情况。 在一般情况下，荧光团发射的光子的脉冲串在空间上完全分离，这使得在特定区域中的所有光子的单个分子的分配。 在这种情况下记录时，衍射限制信号的中心是相同的荧光团的位置。 荧光团的位置，可以计算Zui多纳米精度。 

为什么有机荧光更好

一个超分辨率图像的Zui终解决取决于）每个荧光基团（定位精度）和本地化的精准二）个人荧光标记的兴趣（染色密度的结构）之间的Zui小距离。 染色密度可以影响例如通过免疫染色过程中使用更高的抗体浓度。 定位精度取决于来自体荧光收集，并可以用下式来近似的光子数量：

Δr：显微镜/物镜衍射极限 
N：由一单独的局部荧光团发射的光子数 
Δsms：个别荧光的定位精度

因此，要实现10nm的定位精度，400光子必须从用显微镜递送200nm的衍射极限分辨率的荧光收集。 发射的光子的数目是在第一个实例中与包埋介质组合的荧光团的性质。 作为一个经验法则，有机荧光显示比荧光蛋白更高的亮度和光稳定性。 由此通过这些染料递送光子的数目要高得多和定位精度显著改善。 Zui后，一个较好的超分辨率图像可以与“更强”染料状有机荧光团由于改进定位精度得到！