徕卡显微镜智能控制共振扫描振镜的技术

高时间分辨率激光共聚焦显微镜（HTRCLSM）需要快速的扫描设备。尽管非共振扫描振镜允许完全控制的位置，但只在速度慢，共振扫描仪能够每秒〜25,000行，但提供更少的定位自由。仍然允许缩放和平移功能，几种方法都试过了，用不同的成功。在TCS系列徕卡共聚焦显微镜使用一个非常聪明的解决方案使无级短开关时间缩放。

“生物学是有关生命的研究和生物的自然科学”是生物学的维基百科条目的引言句而在过去的日子显微镜主要关注对象死亡（虽然以前活着），生物显微镜的Zui终目的是可视化生活的对象。虽然小生物样品经常看不活跃，微观角度推出充满活力的活动。细菌已经快速移动鞭毛，细胞和组织表现出的代谢物非常快的改变，囊泡运输在显着的速度和电信号由毫秒范围动作电位广播。遵循这些活动，高帧速率是必需的。在激光共聚焦显微镜早期的做法是引入了并行技术，例如旋转的光盘系统，但他们缺乏真正的共聚焦切片性能。单点扫描器提供Zui佳的光学切片的性能，但通常被认为是慢的。采用共振振镜扫描仪，现代技术可以在500每秒的范围内达到的帧速率。 本文介绍了如何将这些设备的限制已被克服。

振镜扫描仪 - 绘画与激光

为了扫描一个光点在两维区域时，光束的角度已被改变。 这个任务是很容易通过插入反射镜成偏转光束的光束路径解决。 为了进行扫描，在反射镜具有可旋转。 的黄金标准旋转镜是采用所谓的“电流计扫描器”。 这些装置已被广泛用于在激光投影机，用于激光节目和电影放映。

术语“电流计”源于电计量。 以测量电流，线圈被插入一个磁场。一个针被安装在线圈的旋转轴线。 一旦电流流过线圈时，洛伦兹力使针的偏转。 的电流越高，更宽抵抗复位力偏转。 偏转可以被校准用于测量电流。（奥林巴斯显微镜）

另一方面：如果当前是已知的，人们可以产生所需的偏转。对于光指向应用程序（扫描仪），针被反射镜交换。当光束撞击反射镜，反射变化两倍的旋转角度的角度。

进行精确定位，旋转角度由位置传感器解码，安装在旋转杆的另一侧。 一个反馈系统控制的驱动电流，以确保偏转总是恰好在所希望的角度。 这允许扫描速度和静态定位在可用的xy平面的所有点的控制。这些扫描仪被称为“闭环”由于封闭反馈系统。 在成像应用中，一个重要的图案是锯齿扫描。 以所需的速度线扫描是通过在所要求的速度移动光点在一个方向上（“×”）线性地及时执行。 然后，重复该扫描，反射镜被移回以Zui大速度的起始角度。 这个模式是可能的慢行频来替代正弦扫描的二维扫描-标准应用-是由垂直地引入第二扫描器进光束路径产生的。 该第二（“y”）的扫描仪产生的增量在所述第二轴线。 很显然，在y扫描器的速度（在标准条件下）是慢得多相比于x扫描器，因此具有少得多的限制。

在约500 Hz的线频率和512×512像素的全帧，帧速率达到约每秒一个。与固定的样品，这是足够的时间分辨率，并给出大信噪比。 另一方面，成像快速移动的物体时，在100以上每秒的帧频（优选约500每秒）是期望的。如果这些图像是有每帧10行（“条扫描”），一个扫描仪是必要的，可以产生每秒5000线。

尽管扫描仪和扫描反射镜是由轻质材料制成，并尽可能地小，它们是施加显著惯性机械装置。因此，在更高的速度，他们只能执行正弦扫描。在极端情况下，扫描仪已经开发了仅在正弦模式和仅在其共振频率扫描。像秋千，这些设备只能改变其幅度（通过供给更多的能量）和它们的相位，在期间相对于外部标准的位置。目前，可供共振扫描振镜12,000赫兹的频率。当在记录过程中既来回列车（双向成像）数据，线路频率进行成像可以达到24000，因为大多数现代运动图片被使用对应于〜45％的第二全帧，大约相同的频率。在黑暗的一面，这些共振扫描仪无法控制的位置和扫描频率。这种扫描仪提供了一个电磁窃听反馈，但这是太不精确是任何使用。

图1：Zui初，电流计被设计用于测量电流通过的线圈，可以在磁场中旋转的装置。 左：当电流流过线圈时，洛伦兹力倾斜线圈和被固定到旋转轴的针。 倾斜依赖于电流I，可以进行校准。
右：一个更精确的版本是配备有安装在轴代替针的反射镜。 在闪耀准直的光（Zui好的情况下：激光）到镜，偏转可以在屏幕上被监视（飞点法）。
当一个已知的电流被施加时，偏转是可以控制的。 一个编程的电流列车将导致现货的时间运动模式。 这是检流计扫描仪的工作原理。

在场号 - 比变焦倍数是更好的选择

显微镜有圆形光学。如果你往下看显微镜，你所看到的是一个圆。可以如何样品的多观察在给定的放大率由场号FN（Sehfeldzahl，SFZ），它是图像的以mm在目镜（中间图像平面）的场平面的直径指定。如果使用40X镜头，并与现场25号目镜，那么你可以观察的实际面积是直径为625微米的圆形。当然，透镜必须被充分地校正，以处理这样的大场，如果体面成像是目标，并且通常该领域被限制为共焦扫描，以确保足够的图像质量。扫描图像是典型的正方形或长方形。如果扫描指定了一个完整的字段（例如上述的SFZ 25），则对角线的矩形等于场号，和40倍透镜将使625微米的对角线。如果扫描一个正方形，边对应于442微米×442微米。

代替扫描满场的，这是非常简单的只通过减小电流计扫描器的振幅（伸长）扫描，只有一小部分。如果扫描幅度的一半，只有一半的各尺寸的记录。 正方形的区域，然后对应于一季度满场扫描。

尽管如此，像素的数量是相同的，而当一个监视器上显示，该显示器的尺寸没有任何改变，当然。在本质上，较小的扫描已经产生由两个因素的附加放大率。 这种额外的放大倍数是无级可调，并呼吁“扫描缩放”。它不是由光学元件获得的，因此不应混在一起的光学变焦的安排。 因为它不是在显示记录的象素数据的变型，它不应该被混在一起显示缩放选项，无论是。实际上，扫描变焦是机械放大由扫描装置的机械性能（尽管这是电驱动且电子和计算机化控制）来控制。

由于没有限制减少扫描幅度，直到达到零，扫描变焦可以提供无限的放大倍数。然而：像在普通显微镜目镜的放大倍率，也有定义，当扫描变焦跨越有意义使用的地平线规则。这些规则取决于分辨能力和透镜的倍率，并且每个维度记录的像素数。用于成像，扫描变焦以上20倍很少需要。提高放大系数仅用于激光处理，例如漂白或光活化。

由于不同的制造商使用不同的场数，扫描变焦的绝对值没有可比性。为了迷惑额外的运营商，有的甚至使用放大因素小于一。一个更明智的值将是实际使用的场数，只是通过计算对角线的扫描区域和由物镜的倍率乘以此。根据这样的指标，它甚至有可能以比较在不同的光学倍率性能（不同的物镜）。

当未扫描的全部（光）场，一个人可以自由选择该字段的部分被扫描。此功能被称为“淘选”，并且需要扫描的编程偏移，即扫描仪不对称地操作。这仅适用于闭环扫描仪。共振扫描仪需要不同的解决方案平移。

图2：上：视的光电场被完全使用由方形扫描，涉及的中间像场的限制。 的大小对应于对角线方（相同与圆形场（虚线圆），这是通常表示为字段号FN的直径，典型地，Zui大的扫描区域是稍微低于光电场数，因此我们将称之为它的FN 0将它与缩放扫描进行比较。
中间：如果扫描幅度被减小，例如，通过3倍于两个维度，那么使用的字段也是原始场直径的1/3。 光学分辨率保持不变，扫描分辨率增加，因为是有效放大。 这个操作类似于一个3倍变焦相对于原始字段（1×放大）。 为适当的比较，这应显示在FN方面，这里FN = FN 0/3。
底部：当放大扫描开始从中点，被扫描区域可在光学领域内移动。 这被称为泛函数（淘选）。

如何纠正假动作

如前所述，限速元素时扫描是x振镜。如果有需要的折回没有空闲时间，并且将扫描仪可以在一个完美锯齿操作，则每个象素的时间将是1 / F *的x，以f为扫描频率和x的像素的数目。即时扫描仪，这是不完全达到，作为回缩时间是有限的，并且机械伸长的“端部”被切断，因为它们表现出非线性。在较高速度下，可编程扫描仪以正弦模式，这是当然也可以为低速，操作。 共振扫描仪只能扫描正弦。

如果扫描正弦，那么时空关系不再是线性的。作为图像失真是不能接受的，则强度必须在x和y等距离记录中，对应于inequidistant记录时间。 因此，数据记录（像素）的在一条线上的开始时间是在将扫描器动作更快，并且相距较远的线的端部的线的中间致密，作为扫描速度为零时结束，并开始移动在相反的方向。 甲不完全合适，但有可能解决这一问题的办法是使用正弦，这大约是线性的唯一的正中央。但一会损失90％的可用的扫描时间（而激光是在所有的时间），将需要在更广泛的振幅，这反过来会减慢电流计扫描器进行扫描。因此，人们采用了较大部分，如80％的一种列车（在双向模式下工作时它给出60％的时间周期），并施加一个非线性像素时钟。该非线性像素时钟很容易与闭环扫描仪获得的，因为它们提供使用位置外用进行解码。非线性像素倍的第二个效果是，每个象素的记录时间也是位置依赖性。如果一个采用标准电荷放大器强度电流变换中，像素会在边缘处明亮。此外，相对于扫描中心的噪声较少的边缘。对于正常的成像，这不是一个问题。噪声依赖性的方法，如光栅图像的相关性，将遭受这样的记录，因为噪声是高短像素和下在长的像素。 这里，人们必须确保在整个扫描区域（这是在Zui大的Zui短像素的中心的长度）恒定的积分时间。 高频采样和intrapixel积累如在共聚焦显微镜与Leica TCS SP5引入允许每个像素独立的位置和速度的积分时间的控制。

图3：左：具有均匀象素时钟dt的扫描正弦和记录数据时，该信号将被从非等距离的点样品中******，因此，图像会被扭曲。 在该中心，图像将由于扫描仪（：DSç每次距离）的更快的速度扩大。 （：双链ê每个时间距离）的边缘时，图像将由于扫描器的低速挤压。
右：为了获得在空间上等距点的ds数据，象素时钟必须被编程为较长的时间在边缘（DT E）和更短的时间在中心（dt的C）。

一行人的解决方案：使用伦奇光栅和光斩

共振扫描仪不可编程的速度和扫描偏移，缺乏精确的位置读出。仍然采用共振扫描仪与效益，这些缺点需要进行补偿。使用光学标尺第一可行的解决方案作为一个采样时钟是在1995年在波利的共焦手册描述R.钱学森。这种方法利用一个第二，低功率的红色激光引导至后方的扫描镜作为位置探针（也反射）侧。反射探测光穿过一个光栅，它由透明和非透明条纹（光栅的Ronchi），很像一个栅栏。探测光上扫描光栅和光由光电二极管检测到之后。由于栅栏是等距和扫描仪运动正弦调制的探测光施加亮暗图形与正弦波脉冲长度。这些图案的侧面可以用作一个像素时钟，然后将其正弦时刻，但等距离在扫描场空间。

尽管这个概念解决了非线性像素时钟的问题，它有其局限性。像素的Zui大数量是由光栅网格元件的数量排除。像素的数量可能仅在围栏板条的数目的整数部分进行切换。

可用的缩放因子取决于适当的光栅的可用性：提高放大系数要求同等像素数较短（和密集）光栅。因此，没有办法连续的缩放和开关变焦时，人们必须改变光栅的探测光束路径。因此，一组光栅必须是一个光栅存储库中可用-通常是一可旋转的圆盘。

平移不可用这种机械参考测量。

图4：左：用光学机械像素时钟解码共振扫描共聚焦的示意图。 用于成像，激光通过分束镜射向扫描镜和激励荧光的样品（蓝色迹线）。 所发射的光（绿色迹线）由扫描镜退扫描，由分束反射镜反射，并转换成由所述检测器的电信号。 辅助激光被引导到扫描镜（红色迹线）的后侧（也反射）。 它传递一个象素光栅，它导致从检测光电二极管的二进制信号I 第
右：提取的一组像素时钟通过跟踪探测光束（在扫描反射镜的背面反射，X'）上组成的不透明和透明的等距条纹的固定数量的格。 传感器将产生的强度信号I P，然后转换成像素触发脉冲吨PIX。

一个聪明的解决方案：使用锁定并提取整个运动

我们如何可以设计为共振扫描仪的控制，允许任何数量的像素都连续的缩放和选择至Zui高？和单向或双向扫描在用户的请求？一个稳定和精确的解决方案引入徕卡的TCS SP2在2000年这个概念已经被系统中的应用与徕卡共振扫描仪。

共振振镜扫描仪是扭转谐振荡器。他们旋转振荡谐波运动。因此，他们的运动模式是严格的正弦函数。所有我们需要做的是测量运动扫描仪的实际相位和振幅，并将其与激励信号。测量是通过一个红外二极管照射到扫描镜的后表面进行。 为了检测信号，一个位置敏感装置（PSD）的采用。这是一种无定形的，因此连续测量装置，不像一个光栅，其具有元件的预定数量（限制了测量的分辨率）。 从这一点，我们可以提取精确的幅度和相位通过一个锁定方法，该方法允许我们创建一个合成正弦函数类似镜子的真实运动。这是可能的，因为谐振电流计的Q值在1000的范围内。这意味着，该系统总是振荡正弦在谐振频率 - 的偏差小于0.1％时，即使激发通过一个方波。谐振频率取决于温度等环境参数，但我们测量频率，我们可以肯定在Zui佳频率操作扫描器。 这种方法不依赖于光栅的准确性，也没有对调整和更换，例如格栅或其他机械或光学辅助工具。由高品质的测量幅度和振荡器的相位，我们有反射镜的在任何时候都在位置的非常精确的知识。

现在随时知道样品中的点的位置，我们就可以检测到的信号分配到在x和y（和z）的空间坐标。 们可以自由地分解检测强度的列车（我们用一个高频取样连续测量），在任何数目的像素。即：如果像素的Zui大数目是每行如1000中，我们可以从理论上要求1和1000之间的任何扫描格式。

此外，我们可以决定使用所有所测量的信号，其对应于较长的像素倍的X扫描的边缘。或者，以保证相等性质来测量高阶矩像的强度进行相关研究的方差，我们可以限制该像素长度为恒定所有沿x扫描。

正如我们测量和控制的幅度，就可以连续地改变的字段的大小。即：连续的缩放，这是具有机械格引用是不可能的。

如果我们要移动缩放区域在视显微镜的领域，我们可以挂载共振扫描仪可旋转的装置，它允许添加的机械（此处：X方向）抵消。该位置敏感的装置和振荡特性与锁定系统的提取仍然这些条件，这允许我们使用与谐振扫描泛函数，太下工作。

图5：左：一个共振扫描共聚焦与锁定像素时钟解码示意图。用于成像的激光通过一个可编程光声分光器射向扫描镜和激励荧光的样品（蓝色迹线）。 所发射的光（绿色迹线）由扫描镜退扫描，由AOBS传送并转换成由所述检测器的电信号。辅助IR二极管被定向到的扫描镜（红色迹线）的后侧（也反射）。它到达一个位置敏感装置（PSD），它提供了可重现的扫描镜的全部运动的信号。
右：位置控制的可调像素时钟与共振扫描仪的框图。反射镜的运动由位置敏感装置（PSD），其馈入一个锁定放大器监测。在这里，在幅度和相位方面的实际运动（动作）与激励信号（额定值）进行比较。基于DSP的控制器调整从优化运行任何偏差，并提供正确的参数，以像素时钟模块。这里，从显微镜的发射信号被分成在空间上等距离的段（像素时钟）。 每像素的实际积分时间也可控制，并且可以覆盖整个像素的时间（不相等长边缘处与中心），或修剪像素积分时间在时间上等距测量。